Молекулярни методи биологични изследователски и тяхното използване

Молекулярно-биологични методи за изследване, играят важна роля в съвременната медицина, съдебна медицина и биология. Благодарение на напредъка в изследването на ДНК и РНК, човек е в състояние да проучи генома на организма определи причинител, да разпознава желаната нуклеинова киселина в смес от киселини и т.н.

Молекулярно-биологични методи. Какво е това?

Обратно в 70-80s на учените е първият, който дешифрира човешкия геном. Това събитие дава тласък на развитието на генното инженерство и молекулярната биология. Изследване на свойствата на ДНК и РНК означава, че сега е възможно да се използват тези нуклеинови киселини за целите на диагноза болест, проучване ген.

Получаване на ДНК и РНК

Molecular биологични диагностични методи изискват изходен материал: често тази нуклеинова киселина. Има няколко начина за избор на тези вещества от клетките на живите организми. Всяка от тях има своите предимства и недостатъци, и трябва да се вземат предвид при избора на метод за изолиране на нуклеинови киселини в чиста форма.

1. Получаване на ДНК от Marmur. Методът се състои в третиране на сместа от алкохол вещества, утаява Полученият чист ДНК. Недостатъкът на този метод е използването на корозивни вещества, фенол и хлороформ.

2. Изолиране на ДНК на стрелата. Основната съставка, която се използва тук - е гуанидин тиоцианат (GuSCN). Той стимулира отлагането на дезоксирибонуклеинова киселина в специализирани субстрати, от които може да бъде след това събрани с помощта на специален буфер. Въпреки GuSCN - е инхибитор на TCP, и дори малка част от които получава депозирани в ДНК може да повлияе на хода на полимеразна верижна реакция, което е важно, когато се работи с нуклеинови киселини.

3. Валежите от примеси. Методът се различава от предишните с това, че молекулите се не се отлагат dehoksiribonukleinovoy киселина и примеси. За целта се използват йонообменители. Недостатъкът е, че не всички вещества, могат да се утаят.

4. Маса скрининг. Този метод се използва в случаите, когато не е нужно да има точна информация за структурата на молекулата на ДНК, както и необходимостта да се получи някои статистически данни. Причината е, че структурата на нуклеинова киселина могат да бъдат повредени при работа с детергенти, по-специално основи.

Класификация на методите за анализ

Всички молекулно-биологични методи на изследване са разделени в три основни групи:

1. амплификация (като се използва множество от ензими). Това включва PCR - полимеразна верижна реакция, която играе важна роля в много от диагностичните методи.

2. Neamplifikatsionnye. Тази група от методи е свързан директно с работата на смеси от нуклеинови киселини. Примери за това са 3 видове петна, хибридизация на място и т.н.

3. Методи, основани на признаването на сигнала от молекулата на сонда, която се свързва със специфична ДНК или РНК сонда. Пример - хибридизация система хибридните разтвор Capture система (НС2).

Ензимите, които могат да бъдат използвани в молекулярни методи биологични изследвания

Много молекулни техники за диагностика включват използването на широк спектър от ензими. По-долу са използвани най-често:

1. рестрикционен ензим - "отрязани" ДНК молекулата на необходимите части.

2. ДНК полимераза - синтезира молекула двуверижна деоксирибонуклеинова киселина.

3. обратната транскриптаза (обратна транскриптаза) - се използва за синтезиране на ДНК от матрица РНК.

4. ДНК лигаза - е отговорен за образуването на фосфодиестерни връзки между нуклеотиди.

5. екзонуклеазна - премахва нуклеотиди от крайните части на молекулата на дезоксирибонуклеинова киселина.

PCR - основния метод за ДНК амплифициране

Полимеразна верижна реакция (PCR) се използва широко в съвременната молекулярна биология. Този метод, при които един ДНК молекула може да се получи голям брой копия (амплифициране молекула).

Основните функции на PCR:

- диагностика на заболявания;

- клониране на ДНК сегменти, Gene.

За провеждане на полимеразна верижна реакция изисква следните елементи: първоначалното ДНК молекула, термостабилна ДНК полимераза (Taq или Pfu), деоксирибонуклеотидни фосфати (източници на азотни бази), праймерите (2 праймерни една ДНК молекула) и се буферна система, която може да извършва всички реакции.

PCR се състои от три стъпки: денатуриране, като хибридизирането на праймера и удължение.

1. денатуриране. При температура 94-95 градуса по Целзий proshodit пробие водородните връзки между двете вериги на ДНК, и като резултат на това се две едноверижни молекули.

2. темперирани праймери. При температура 50-60 градуса по Целзий настъпва праймери за присъединяване на краищата на едноверижни молекули нуклеинови киселини, в зависимост от вида на допълване.

3. Удължаване. При температура от 72 градуса се синтезира дъщеря двойноверижна молекули дезоксирибонуклеинова киселина.

ДНК секвениране

Молекулярни методи биологични изследвания често изискват познаване на последователността на нуклеотиди в молекулата на дезоксирибонуклеинова киселина. За определяне на генетичния код в последователност. Молекулярна диагностика на бъдещето ще се основава на знанията, придобити при определянето на човешката последователност.

Следните видове секвениране:

• секвениране на Maxam-Gilbert;
• Sanger секвениране;
• пиросеквениране;
• nanoporovoe секвениране.